Một nghiên cứu về Hội chứng Zoea-2 trong trại giống ở Ấn Độ, phần 1

Tổng quan và phương pháp kiểm tra tỷ lệ tử vong của tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương

Các trại giống tôm Ấn Độ đã trải qua tỷ lệ chết của ấu trùng trong giai đoạn zoea-2, với sự lột xác chậm và dẫn đến tử vong nặng.

Nuôi tôm ở Ấn Độ là một hoạt động phát triển nhanh và năng động, chủ yếu là tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương ( Penaeus vannamei) , được giới thiệu vào năm 2009. Sự thành công của ngành tôm thương mại phụ thuộc chủ yếu vào nguồn giống có chất lượng và khỏe mạnh, và 276 trại tôm giống có liên quan đến việc sản xuất giống tôm thẻ chân trắng không mang mầm bệnh (SPF) và phục vụ cho ngành nuôi trồng tôm.

Do nhu cầu liên tục của ngành nuôi trồng thủy sản ngày càng tăng, nuôi tôm thâm canh đã được cải thiện đáng kể trong thập kỷ này. Xu hướng tăng cường và thương mại hóa ngày càng tăng này đã làm trầm trọng thêm các dịch bệnh động vật.

Bệnh là những thách thức đáng kể đối với các hệ thống nhân giống ấu trùng tôm, đặc biệt là các bệnh do vi khuẩn như bệnh do vi khuẩn phát quang gây ra hậu quả kinh tế nghiêm trọng cho hoạt động của trại giống. Mất trứng và ấu trùng quy mô lớn đã được báo cáo do bệnh nấm ấu trùng do Legenidium spp  và Sirolpidium spp gây ra. Sự tắc nghẽn của ấu trùng được gây ra bởi các động vật nguyên sinh như Zoothamnium và Vorticella , ngoài ra còn có các bệnh khác có nguồn gốc virus và vi khuẩn.

Tuy nhiên, kể từ khi giới thiệu tôm thẻ chân trắng, trại giống tôm Ấn Độ đã trải qua tỷ lệ tử vong của ấu trùng trong giai đoạn zoea-2, với sự lột xác chậm và dẫn đến tử vong nặng. Trong trường hợp ấu trùng tôm thẻ chân trắng ở Ecuador, Mexico và Hoa Kỳ, sự mất mát ấu trùng tương tự đã được ghi nhận với hội chứng zoea-2 hồi năm 1993.

Sự xuất hiện của tỷ lệ tử vong trong các giai đoạn zoeal của tôm thẻ chân trắng thường được báo cáo trong các trại giống tôm Ấn Độ đã cung cấp cho chúng tôi sự kích thích để điều tra vấn đề một cách toàn diện, xem xét có thể là sự tham gia của các yếu tố sinh học và phi sinh học. Bài viết này được chuyển thể từ Aqua Cultura (Ecuador), # 119, tháng 9 năm 2017. Chúng tôi ghi nhận Giáo sư Pushpa Viswanathan của Khoa Truyền kính hiển vi điện tử của Viện Ung thư Chennai vì đã giúp đỡ và hỗ trợ trong nghiên cứu TEM, và cũng cảm ơn các trại giống tôm ở Tamil Nadu và Andhra Pradesh vì đã đóng góp mẫu và thông tin cho nghiên cứu này; và công nhận Ủy ban đăng ký động vật quốc tế (ICAR) của Ấn Độ đã hỗ trợ tài chính để thực hiện công việc này.

Chúng tôi đã điều tra tỷ lệ tử vong của tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương ( Penaeus vannamei) , trong giai đoạn zoea ở 15 trại giống tôm nằm ở bờ biển phía đông Ấn Độ. Bệnh này thường được gọi là hội chứng zoea-2, được đặc trưng bởi sự giảm tỷ lệ cho ăn của ấu trùng zoea-1 và zoea-2 sớm, do sự thay đổi trong biến đổi hình thái của chúng dẫn theo tỷ lệ tử vong cao. Các nghiên cứu kính hiển vi cho thấy những bất thường toàn thân ở ấu trùng bị ảnh hưởng cũng như các biểu hiện bệnh lý ở gan tụy và ruột. Phát hiện vi sinh cho thấy sự chiếm ưu thế của Vibrio alginolyticus trong hầu hết các trại giống (chín) bị ảnh hưởng bởi hội chứng zoea-2.

Kiểm tra mô học ở gan tụy và ruột cho thấy không bào mòn, ngoài ra còn có sự tách rời của các tế bào biểu mô và sự tan rã của màng đáy của biểu mô ruột. Các giao thức phản ứng chuỗi polymerase (PCR) của OIE (Tổ chức Thú y Thế giới) đã xác nhận rằng các mầm bệnh virus gây bệnh ở tôm được liệt kê trong OIE không có ở ấu trùng bị ảnh hưởng. Quan sát siêu âm về biểu hiện bệnh lý ở gan và ruột không thể tiết lộ sự hiện diện của mầm bệnh. Dữ liệu về các thông số chất lượng nước là trong phạm vi bình thường và dường như không ảnh hưởng đến sự bùng phát của hội chứng zoea-2 ở các khu vực vườn ươm.

Các chế độ cho ăn (với vi tảo Skeletonema, Chaetoceros, Thalassia) đã thống nhất trong suốt chu kỳ ấu trùng và người ta cũng thấy rằng chúng không liên quan đến hội chứng zoea-2. Các biểu hiện bệnh lý của gan tụy và ruột tiếp tục cho thấy sự suy giảm khả năng tiêu hóa và hấp thu, dẫn đến sự lột xác chậm và cái chết của ấu trùng theo cách dần dần và tiến triển, với tỷ lệ tử vong tích lũy từ 30 đến 100% trong giai đoạn zoea-2. Người ta cũng xác định rằng việc lưu trữ ấu trùng nauplii liên tục trong ba đến bốn ngày trong cùng một đơn vị ủ ấu trùng làm trầm trọng thêm tỷ lệ mắc bệnh trong chín vườn ươm bị ảnh hưởng (OR-48, IC 2.5-932.9). Căn bệnh học (nguyên nhân gây bệnh) của hội chứng zoea có thể không phải do các tác nhân truyền nhiễm đã biết, một kết quả bổ sung từ việc giải thích các nghiên cứu của chúng tôi.

Phương pháp: Lấy mẫu và kiểm tra vi sinh 

Nghiên cứu bao gồm 15 trại sản xuất tôm thương mại dọc theo bờ biển phía đông Ấn Độ, bao gồm sáu trại từ Tamil Nadu (quận Kancheepuram và Vilupuram) và chín từ Andhra Pradesh (quận Nellore, Prakasham và East Godavari). Các mẫu ấu trùng được thu thập trong điều kiện sống từ các chu kỳ ấu trùng bị ảnh hưởng bởi hội chứng zoea. Các zoeas sống được quan sát dưới kính hiển vi quang học và các mẫu ấu trùng được bảo tồn trong cố định Davidson AFA cho mô học. Các mẫu zoeal đã được cố định trong 2,5% glutaraldehyd và dung dịch đệm natri cacodylat 0,1 M để quan sát bằng kính hiển vi điện tử. Ấu trùng cũng được bảo tồn 90% ethanol và RNAlater (Ambion) để phát hiện mầm bệnh bằng phân tích PCR.

Trong quá trình kiểm tra vi sinh, các mẫu ấu trùng 0,5 gram đã được thu thập và đặt vào dung dịch muối đệm phosphat vô trùng (PBS), đồng nhất hóa và cấy vào môi trường muối mật muối thiosulfate (TCBS) và agar biển Zobell (ZMA). Tổng số tấm (TPC) được thực hiện bằng các tấm pha loãng tấm nối tiếp 10 lần được nhân đôi trên ZMA. Các tấm được ủ ở 30 ± 1 độ C và được quan sát sau 24 giờ. Dựa trên các đặc điểm kiểu hình, các mẫu nuôi cấy thuần chủng của hệ vi khuẩn dị dưỡng chiếm ưu thế đã được xác định.

Trích xuất DNA, tách RNA và tổng hợp cDNA

DNA bộ gen được chiết xuất từ các mẫu ấu trùng, như được mô tả trong thí nghiệm của Rajendran et al. (2016). Các mẫu ấu trùng được đồng nhất hóa và tiêu hóa trong 10 phút ở 95 độ C trong 500 ml dung dịch đệm ly giải (50 mM Tris, 1 mM methylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 500 mM NaCl 1% SDS) và 0,1 mg Proteinase. ở 12.000 vòng / phút trong 10 phút ở 4 độ-C. Sau khi ly tâm, phần nổi phía trên được thu thập cẩn thận và hai thể tích ethanol được thêm vào và duy trì ở nhiệt độ tối thiểu 20 độ-C trong một giờ. Hỗn hợp này sau đó được ly tâm ở 12.000 vòng / phút trong 10 phút ở 4 độ C. Trầm tích DNA được rửa bằng ethanol lạnh 70 phần trăm, sấy khô trong không khí, lơ lửng trong nước không có nuclease và được bảo quản ở âm 20 độ C.

RNA được chiết xuất từ các mẫu ấu trùng bằng thuốc thử TRIzol ™ theo giao thức của nhà sản xuất. Số lượng và chất lượng của RNA chiết xuất được đánh giá bằng máy quang phổ nano và được lưu trữ ở âm-80 độ-C. Sự chuyển dịch ngược được thực hiện bằng cách sử dụng bộ tổng hợp iScript cDNA trong 10 reactionsl phản ứng, theo hướng dẫn của nhà sản xuất và cDNA được lưu trữ ở âm -20 độ-C cho đến khi sử dụng tiếp.

Phát hiện mầm bệnh virus  

Axit nucleic được sử dụng để phát hiện mầm bệnh virus, được chiết xuất từ các mẫu ấu trùng bằng PCR. Để phát hiện Virus Hội chứng đốm trắng (WSSV), chúng tôi đã sử dụng giao thức PCR lồng nhau.

Các loại virus DNA và RNA khác - cụ thể là hoại tử truyền nhiễm dưới da và tạo máu (IHHNV), baculovirus monodon (MBV), virus gây bệnh gan (HPV), virus gây bệnh vàng da (YHV), virus gây bệnh vàng da (TSV) bằng các xét nghiệm PCR được đề xuất bởi OIE. Virus hội chứng tử vong Covert (CMNV) đã được kiểm tra bằng giao thức RT PCR lồng nhau, được mô tả bởi Zhang et al. (2014). PCR được thực hiện trong một máy điều nhiệt. Một phần của sản phẩm PCR được khuếch đại đã được phân giải trên các gel agarose-Tris-acetate-EDTA (TAE) 2,0% được nhuộm bằng 0,5 μg / mL ethidium bromide và DNA được khuếch đại cùng với dấu hiệu DNA 100 bp được chiếu bằng tia UV sử dụng hệ thống tài liệu gel (Phòng thí nghiệm Bio-Rad, Hoa Kỳ).

Kiểm tra kính hiển vi ánh sáng

Các mẫu ấu trùng được thu thập trong điều kiện sống của chu kỳ ấu trùng bình thường và bị ảnh hưởng đã được quan sát dưới kính hiển vi ánh sáng. Đối với mô học, các mẫu zoeal đã được cố định trong thiết bị cố định Davidson AFA trong 48 giờ và được xử lý bằng các kỹ thuật mô học thông thường. Các mẫu zoeal được khử nước thông qua các rượu được phân loại (lần lượt là 70, 90 và 100%) trong 60 phút. Sau khi mất nước, các mô được làm sạch hai lần bằng xylen trong 60 phút, tiếp tục thấm vào sáp parafin trong 2 giờ và sau đó các khối được chuẩn bị bằng mô Leica EG 1160. Các phần mô dày 4-5 mm thu được trên các phiến parafin siêu nhỏ sạch bằng microtome Leica RM 2145 và các phần sau đó được xử lý bằng nhuộm hematoxylin và eosin theo quy trình chuẩn.

Kính hiển vi truyền điện tử

Các mẫu ấu trùng được cố định trong 2,5% glutaraldehyd trong dung dịch đệm natri cacodylat 0,1 M (pH 7,3) trong 8 giờ ở 8 độ C, cố định trong 0,1% osmium tetroxide được chuẩn bị, sử dụng cùng dung dịch đệm ở 8 độ C trong 2 giờ và được xử lý theo các giao thức của Naveenkumar et al. (2013). Các phần được kiểm tra bằng Kính hiển vi điện tử truyền qua JEM 1400 ở điện áp 80 kV và máy chụp ảnh quang được lấy tại Viện nghiên cứu ung thư (WIA) Adyar, Chennai.

Phân tích thống kê và dịch tễ học

Hệ số tỷ lệ không đồng đều, đo lường mức độ liên quan giữa bệnh tật và phơi nhiễm với yếu tố rủi ro, được ước tính bằng phân tích bảng đơn Epi Info ™ 7.1.2 ở mức độ tin cậy 95%, bằng xấp xỉ chuỗi Taylor và hai p -giá trị bằng cách sử dụng thử nghiệm chính xác của Fisher.