Đặc điểm của vi khuẩn đường ruột ở tôm sú trưởng thành tự nhiên và thuần dưỡng - Phần 2

Thành phần phân loại của vi khuẩn đường ruột ở tôm sú lấy từ dữ liệu giải trình tự hệ gen dựa trên nguyên lý "đọc trình tự bằng tổng hợp"

Năm ngành (phyla) chính có liên quan đến đường ruột tôm sú là Actinobacteria, Fusobacteria, Bacteroides, Firmicutes và Proteobacteria (Hình 3). Trong số đó, Proteobacteria (> 70% tổng số chuỗi trình tự) chiếm ưu thế trong tất cả các ruột tôm, tiếp theo là Firmicutes, ngoại trừ thư viện của nhóm WC2. Thư viện của nhóm WC2 có 69% tổng số trình tự thuộc về Firmicutes và 26% tổng số trình tự là từ Proteobacteria. Xét đến sự đa dạng trong nhóm, tôm được đánh bắt tự nhiên (WC) có nhiều sự khác biệt hơn trong phân bố ngành, trong khi đó tôm thuần dưỡng (DB) có sự phân bổ tương đối giống nhau, có Proteobacteria là ngành chính tiếp sau đó là Firmicutes (Hình 3). Để hình dung thành phần vi khuẩn theo thứ tự phân cấp, biểu đồ hình tròn được xây dựng để thể hiện sự phong phú của vi khuẩn trong đường ruột của tôm sú được đánh bắt tự nhiên và tôm sú thuần dưỡng (Hình 4 và Hình S1). Chỉ những ngành có tổng số trên 100 lượt đọc giải trình tự hệ gen dựa trên nguyên lý "đọc trình tự bằng tổng hợp" mới được xây dựng thành các nút phân loại. Vibrio và Photobacterium chiếm ưu thế trong cả sáu thư viện, điều này cho thấy rằng các chi vi khuẩn này đã thích nghi tốt với các điều kiện trong đường ruột của tôm sú và các môi trường nước xung quanh. Điều đáng ngạc nhiên là Lactobacillus cũng xuất hiện ở mức phong phú trong thư viện WC2 (Hình S1A). Lactobacillus có thể được tìm thấy trong đường ruột của các động vật thủy sinh và môi trường biển, do đó, lượng Lactobacillus dồi dào bất ngờ trong thư viện WC2 có thể được lấy từ thức ăn đã được ăn vào bụng.

Hình 3. Sự phân bố tần suất của ngành vi khuẩn trong ruột của tôm sú từ các thư viện giải trình tự hệ gen dựa trên nguyên lý "đọc trình tự bằng tổng hợp" của nhóm được đánh bắt tự nhiên (WC1, WC2 và WC3) và nhóm thuần dưỡng (DB1, DB2 và DB3).

Hình 4. So sánh các thành phần vi khuẩn trong đường ruột của tôm được đánh bắt tự nhiên (WC1, WC2 và WC3) và tôm thuần dưỡng (DB1, DB2 và DB3).

Biểu đồ hình tròn của cây phân cấp phản ánh sự phong phú tương đối của từng chi từ mỗi thư viện (màu đỏ đại diện cho DB1, màu xanh lam đại diện cho DB2, màu xanh lá cây đại diện cho DB3, màu vàng đại diện cho WC1, màu hồng đại diện cho WC2 và màu xanh nhạt đại diện cho WC3).

Trong khi các thư viện WC được phân bố rộng rãi trong tất cả các nút phân loại thì các thư viện DB chủ yếu được phân phối trong các lớp Gammaproteobacteria và Clostridia (Hình S1). Điều thú vị là Fusibacter (lớp Clostridia) được tìm thấy với tỷ lệ cao hơn trong nhóm DB so với nhóm WC (Hình S1B). Tần số vi khuẩn và sự phân loại của chúng được tóm tắt trong Bảng S1. Các bài đọc giải trình tự hệ gen dựa trên nguyên lý "đọc trình tự bằng tổng hợp" không thể được phân loại ở cấp độ chi đã được xếp vào bảng xếp hạng phân loại gần nhất (Bảng S1).

Bằng chứng về quần thể vi khuẩn đường ruột phổ biến ở tôm sú trưởng thành

Từ sự phân bố OTU (97% tương tự) giữa sáu thư viện (Hình 5), 1,541 OTU được tìm thấy là duy nhất trong các thư viện WC và chỉ có 37 OTU được chia sẻ trong nhóm (2.4%) (Hình 5A). Mặt khác, 689 OTU duy nhất đã thu được trong các thư viện thuần dưỡng và 18 OTU là phổ biến trong nhóm này (2.6%) (Hình 5B), điều này phản ánh sự khác biệt của vi khuẩn giữa tôm sú được đánh bắt tự nhiên và tôm sú thuần dưỡng riêng lẻ. Những vi khuẩn này có lẽ có thể đại diện cho các quần thể vi khuẩn trong thời gian ngắn. Các OTU được chia sẻ được gán (chỉ định) cho các loài gần nhất dựa trên bảng phân tích Blast để xác định các loài vi khuẩn phổ biến (Hình 5C). Điều thú vị là tất cả 18 OTU được chia sẻ trong các thư viện thuần dưỡng là một tập hợp con của 37 OTU được chia sẻ trong các thư viện WC và chúng có thể là một phần của vi khuẩn đường ruột cốt lõi ở tôm sú trưởng thành. Các OTU được chia sẻ được phân loại thành Proteobacteria, Firmicutes và Bacteroidetes. Phylum Proteobacteria chứa các OTU được chia sẻ nhiều nhất trong số sáu thư viện, bao gồm Novosphingobium, Photobacterium, Pseudomonas, Sphingomonas, Undibacterium và Vibrio (Hình 5C). Trong số các Firmicute, có một OTU được chia sẻ được phân loại thành Fusibacter paucivorans, trong khi đó OTU khác chỉ có thể được phân loại ở cấp độ ngành (phylum). Chỉ có Cloacibacterium normanense từ ngành Bacteroidetes là phổ biến trên các thư viện WC và DB.

Hình 5. Phân tích OTU được chia sẻ về các lượt đọc giải trình tự hệ gen dựa trên nguyên lý "đọc trình tự bằng tổng hợp" từ đường ruột của tôm sú.

Biểu đồ Venn đại diện cho các OTU được chia sẻ và độc nhất ở mức độ giống nhau 97% trong các thư viện của (A) nhóm đánh bắt tự nhiên (WC1, WC2 và WC3) và (B) nhóm thuần dưỡng (DB1, DB2 và DB3). Các lượt đọc được chia sẻ được phân loại dựa trên BLAST (C) bằng các tiêu chí sau; độ tương đồng ≤97% được phân loại với chủng loại gần nhất, ≤90% đối với chi gần nhất ≤90% đối với ngành gần nhất.

Mặt khác, có sự khác biệt rõ rệt giữa cấu trúc vi sinh vật của tôm được đánh bắt tự nhiên và tôm thuần dưỡng. Từ 37 OTU được tìm thấy từ các thư viện WC, có 19 OTU không xuất hiện trong quá trình thuần dưỡng bao gồm một số vi khuẩn trước đây được tìm thấy trong trầm tích biển hoặc các sinh vật biển như Gilvibacter sediminis, Microbulbifer sp., Donghicola xiamenensis, Tenacibaculum crassostreae, Maritimibacter alkaliphilus, Phaeobacter và Roseovarius pacificus. Ngoài ra, hai loài Vibrio chỉ được tìm thấy trong nhóm WC. Điều thú vị là một loại vi khuẩn sản xuất kháng sinh mang tên Janthinobacterium lividum cũng chỉ được tìm thấy trong nhóm WC.

Phân tích tọa độ chính (PCoA) dựa trên trọng số khoảng cách UniFrac (thước đo khoảng cách được sử dụng để so sánh các cộng đồng sinh học) cho thấy rằng các cộng đồng vi khuẩn trong ruột của mỗi con tôm trong nhóm WC được tách biệt với nhau, điều này cho thấy sự khác biệt riêng lẻ, trong khi đó nhóm DB được tập hợp lại gần nhau hơn (Hình 6). Mô hình PCoA cho thấy rằng các quần thể vi khuẩn ở tôm sú thể hiện nhiều điểm tương đồng hơn trong nhóm trong khi đó tôm ở nhóm WC có sự biến đổi cao hơn. Tuy nhiên, bảng phân tích thống kê về sự đa dạng của vi khuẩn trong đường ruột không cho thấy sự khác biệt đáng kể nào (P-value> 0.05) giữa tôm trong nhóm WC và nhóm DB.

Hình 6. Phân tích tọa độ chính (PCoA) dựa trên phân tích trọng số UniFrac của các quần thể vi khuẩn có liên quan đến đường ruột của tôm sú từ nhóm đánh bắt tự nhiên (WC1, WC2 và WC3) và nhóm thuần dưỡng (DB1, DB2 và DB3).

Phân tích sự đa dạng của vi khuẩn bằng điện di DNA biến tính trên gel gradient

Các kiểu vi khuẩn trong đường ruột của tôm được đánh bắt tự nhiên và tôm thuần dưỡng được so sánh bằng điện di biến tính trên gel gradient (DGGE) (Hình 7). Các dải điện di biến tính trên gel gradient (DGGE) từ mỗi mẫu vật được chọn lọc để giải trình tự hệ gen(Hình 7A). Phần lớn các dải DGGE từ tất cả sáu thư viện rất giống với vi khuẩn từ Vibrio và Photobacterium. Một dải DGGE chiếm ưu thế tương tự như Lactobacillus sp. (Hình 7A, dải B1) chỉ được tìm thấy trong WC2. Một trình tự tương tự như Thalassomonas sp. (dải C1) cũng được tìm thấy trong WC3. Chuỗi các dải DGGE tương tự như Fusibacter đã được tìm thấy trong DB1 và DB2. Phù hợp với kết quả giải trình tự hệ gen dựa trên nguyên lý "đọc trình tự bằng tổng hợp", phân tích cấu hình của dải DGGE theo cụm dựa trên ma trận khoảng cách Pearson cho thấy rằng quần thể vi khuẩn ở tôm được đánh bắt tự nhiên thể hiện sự biến đổi cá thể cao hơn so với quần thể vi khuẩn ở tôm thuần dưỡng (Hình 7B).

Hình 7. Phân tích điện di biến tính trên gel gradient (DGGE) của các cộng đồng vi khuẩn đường ruột ở tôm sú.

Các cấu trúc vi khuẩn từ đường ruột của tôm được đánh bắt tự nhiên (WC1, WC2 và WC3) và tôm thuần dưỡng (DB1, DB2 và DB3). Các dải DGGE được chọn lọc là trình tự để xác định vi khuẩn (A) và các cấu hình DGGE được phân nhóm bằng cách sử dụng phương pháp UPMGA (một trong những phương pháp khoảng cách để xây dựng cây phát sinh chủng loại, đây là phương pháp gom cụm không có trọng số, dùng trung bình số học) dựa trên sự tương quan của ma trận Pearson (B).