Phát triển vắc-xin Lactococcus garvieae tự sinh cho cá rô phi sông Nin

Kết quả gợi ý bảo vệ cá, phương pháp thay thế thử nghiệm vắc-xin

Kết quả của nghiên cứu này cho thấy autovaccine được phát triển bảo vệ cá rô phi chống nhiễm trùng từ vi khuẩn Lactococcus garvieae. Ảnh của Bjorn Christian Torrissen / CC BY-SA (https://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0).

Chăn nuôi cá rô phi ở Zambia là một ngành tương đối trẻ nhưng lại là ngành đang phát triển nhanh chóng. Mặc dù ngành công nghiệp bắt đầu vào những năm 1990, nhưng vào năm 2010 khi nông nghiệp thương mại chủ yếu chăn nuôi bằng lồng tăng cường hoạt động trên hồ Kariba và mở rộng sản xuất. Sản lượng nuôi trồng thủy sản hàng năm hiện tại khoảng 30.000 tấn (MT).

Nhưng cũng như việc nuôi cá thâm canh ở những nơi khác, sự gia tăng sản lượng cá ở hồ Kariba sớm gặp phải các vấn đề dịch bệnh. Sự bùng phát của vi khuẩn gây bệnh Lactococcus garvieaehave (một mầm bệnh cá được biết đến ảnh hưởng đến cá nước mặn ở Viễn Đông, đặc biệt là cá hồi cầu vồng, cá đuôi vàng Nhật Bản và cá đối xám. Vi khuẩn này gây ra các tổn thương trong nội mô mạch máu, dẫn đến xuất huyết và xuất huyết ở bề mặt của các cơ quan nội tạng.) đã được trải nghiệm kể từ khi mở rộng sản xuất vào đầu thập kỷ này.

Vi khuẩn L. garvieae được biết đến nhiều do gây nhiễm và gây bệnh cho các loài cá vây khác như cá hồi cầu vồng đuôi vàng. Các dấu hiệu lâm sàng bao gồm chứng mắt lồi, viêm kết mạc, bệnh hắc tố, bơi lội thất thường, chán ăn, xuất huyết nội và tắc nghẽn mạch máu, viêm phúc mạc, viêm màng não và nhiễm trùng huyết.

Đối với cá rô phi, nhiễm khuẩn L. garvieae gây ra một căn bệnh mới nổi mà đã trở nên nghiêm trọng hơn nhiều trong thập kỷ qua. Những nhiễm trùng này nghiêm trọng nhất khi nhiệt độ nước trên 20 độ C. Thiệt hại kinh tế xảy ra do tỷ lệ tử vong (cao hoặc thấp), chất lượng cá bị đánh giá thấp do những tổn thương trên da không đẹp mắt và tốc độ tăng trưởng giảm. Hiện tại không có vắc-xin thương mại nào sẵn có trên thị trường có khả năng bảo vệ cho cá rô phi.

Bài báo này (được điều chỉnh và tóm lược từ bản gốc) báo cáo về một nghiên cứu dùng để phát triển toàn bộ tế bào vi khuẩn, vắc-xin tự sinh, vắc-xin gốc dầu nhằm bảo vệ cá rô phi sông Nin (Oreochromis niloticus) chống lại nhiễm trùng L. garvieae. Vắc-xin tự sinh được sản xuất theo yêu cầu và được sản xuất ở quy mô nhỏ cho đến quy mô vừa và dựa trên mầm bệnh được phân lập từ trang trại nơi mà chúng sẽ được sử dụng. Chúng có ưu điểm là ít tuân theo các quy định nghiêm ngặt áp dụng đối với vắc-xin thương mại và cho phép sản xuất sẵn nhanh hơn mà không cần đặc tính đầy đủ và toàn diện khi đối mặt với dịch bệnh.

Thiết lập nghiên cứu

Tổng cộng 460 con cá rô phi sông Nin khỏe mạnh (trọng lượng trung bình 41.5 ± 16.5 gram) đã được thu mua từ Palabana Fisheries (một trang trại cá thương mại không có tiền sử dịch bệnh và nằm ở quận Chirundu, phía đông nam Zambia) và được vận chuyển đến phòng thí nghiệm ẩm ướt tại Trường Thú y của Đại học Zambia. Cá được nuôi trong bể sục khí có dung tích 500 lít chứa nước khử clo chảy qua dòng chảy một chiều và được để thích nghi khoảng 10 ngày trước khi bắt đầu thí nghiệm. Cá rô phi được cho ăn hàng ngày bằng thức ăn viên thương mại với tỷ lệ 3% trọng lượng cơ thể. Trong suốt quá trình thử nghiệm, nhiệt độ nước trung bình là 20 ± 2 độ C, nồng độ oxy hòa tan trung bình hàng ngày là 7.9 ± 2 mg/L và chỉ số pH là 7 ± 0.2.

Đối với các kháng nguyên và công thức vắc-xin thì loài L. garvieae được sử dụng trước đây được phân lập từ một con cá bị bệnh trước đó tại một trang trại trên hồ Kariba. Các vi khuẩn được nhân giống, ủ, ly tâm và sau đó khử hoạt tính. Vắc-xin được bào chế bằng 109 CFU (đơn vị hình thành lạc khuẩn)/mL dưới dạng nhũ tương trong nước sử dụng tá dược ISA 763 VG (một tác nhân dược lý hoặc miễn dịch giúp cải thiện phản ứng miễn dịch của vắc-xin) từ Seppic, Pháp và dựa theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Nhóm tá dược duy nhất được điều chế theo cách tương tự nhưng không có vi khuẩn. Các chế phẩm sau đó được bảo quản ở nhiệt độ 4 độ C cho đến khi được sử dụng.

450 con cá được chia thành ba nhóm [nhóm Đối chứng (trong dung dịch nước muối đệm phốt phát hoặc gọi tắt là PBS), nhóm Tá dược và nhóm Vắc-xin], mỗi nhóm có 150 cá thể. Cá ở nhóm đối chứng được tiêm PBS, nhóm Tá dược chỉ được tiêm tá dược và nhóm Vắc-xin được tiêm vắc-xin L. garvieae. Tổng số cá trong mỗi nhóm là 150 cá thể. Mỗi nhóm được chia thành hai nhóm nhỏ bằng nhau, một nhóm để quan sát (giám sát) và nhóm còn lại để lấy mẫu. Để lấy mẫu, mỗi nhóm được đặt trong một bể riêng (A-C), mỗi bể chứa 90 cá thể. Phần còn lại của cá được gộp chung trong bể D (giám sát), chứa 60 con cá của nhóm đối chứng, 60 con cá của nhóm được tiêm vắc-xin và 60 con cá của nhóm tá dược, tất cả được trộn lẫn lại với nhau (Hình 1). Cá trong bể D được đánh dấu bằng cách cắt vây lưng, vây đuôi hoặc không có dấu vết để phân biệt các cá thể giữa các nhóm. Tất cả cá được tiêm vào trong màng bụng bằng 0.1 ml vắc-xin, tá dược duy nhất hoặc PBS.

Hình 1: Sơ đồ cho thấy thiết kế thí nghiệm của nghiên cứu. Các nhóm cá khác nhau được tiêm trong màng bụng với các chế phẩm được chỉ định và cho phép một khoảng thời gian 42 ngày để phát triển một phản ứng miễn dịch. Sau đó, con cá đã được thử thách với 9 x 105 CFU vi khuẩn cho mỗi con cá. Nhóm kiểm soát (PBS); Vac = nhóm tiêm chủng; Adj = nhóm chỉ bổ trợ; DPV = ngày đăng tiêm chủng: DPC = Ngày thử thách.

Sau khi tiêm vắc-xin, tất cả cá trong bốn bể (A, B, C và D) được cho một khoảng thời gian sáu tuần để gây cảm ứng miễn dịch (Hình 1). Vào ngày thứ 43 sau khi tiêm vắc-xin (dpv), cá đã được thử thách bằng cách tiêm vào trong màng bụng 0.1 ml huyền phù L. garvieae (9.6 x105 CFU vi khuẩn/cá). Việc theo dõi được thực hiện vào khoảng 28 ngày sau thử thách (dpc) mà trong suốt khoảng thời gian đó các dấu hiệu lâm sàng đã được ghi nhận lại và lấy mẫu để phân lập lại vi khuẩn.

Để biết thông tin chi tiết về các kháng nguyên và công thức vắc-xin; tiêm phòng cá; thử thách thí nghiệm; bộ sưu tập mẫu; các xét nghiệm trong phòng thí nghiệm và các quy trình thí nghiệm khác được sử dụng; và các phân tích thống kê hãy tham khảo các ấn phẩm gốc.

Kết quả và thảo luận

Trong các nhóm thử nghiệm, các dấu hiệu lâm sàng của bệnh được quan sát thấy chủ yếu ở nhóm đối chứng (PBS) và nhóm chỉ được tiêm tá dược. Dấu hiệu phổ biến nhất là mờ mắt (một bên hoặc hai bên), có hoặc không có biểu hiện chứng mắt lồi. Tần số cao nhất là trong nhóm đối chứng, theo sau là nhóm chỉ tiêm tá dược. Trước đó, cá có dấu hiệu lâm sàng được quan sát thấy lần đầu tiên vào các ngày sau thử thách (dpc) và lên đến cực điểm vào ngày thứ 5 sau thử thách.

Ở nhóm tá dược, sự khởi đầu của các dấu hiệu lâm sàng là vào 5 ngày sau thử thách sau đó là 7 ngày sau thử thách. Ở nhóm được tiêm phòng vắc-xin, chỉ có hai con cá có dấu hiệu lâm sàng, một con biểu hiện lâm sàng ở ngày thứ 3 sau thử thách, có khả năng do chấn thương vật lý chứ không liên quan đến thách thức mầm bệnh và con còn lại biểu hiện lâm sàng ở ngày thứ 14 sau thử thách, lần này có biểu hiện mờ giác mạc. Không có trường hợp tử vong nào đã được quan sát thấy ở bất kỳ nhóm nào.

Những phát hiện của chúng tôi cho thấy cơ chế bảo vệ của cá đạt được có khả năng là thông qua một phản ứng kháng thể trung gian. Không có dấu hiệu lâm sàng hoặc những thay đổi nào diễn ra sau khi cá chết được quan sát thấy ở nhóm được tiêm vắc-xin và cũng không có vi khuẩn L. garvieae nào được phân lập lại từ bất kỳ mô nào (ngoại trừ lá lách của một con cá) tại bất kỳ thời điểm nào sau thử thách. Ngược lại, các dấu hiệu lâm sàng và những thay đổi xảy ra sau khi chết được quan sát thấy ở các nhóm chỉ được tiêm tá dược và nhóm đối chứng không được tiêm vắc-xin trong 14 ngày đầu tiên sau thử thách. Hơn nữa, L. garvieae đã được phân lập lại nhiều hơn đáng kể từ các nhóm đối chứng và và nhóm chỉ được tiêm tá dược trong nghiên cứu này trong bảy ngày đầu tiên.

Không có vi khuẩn nào được phân lập lại từ bất kỳ loài cá nào ở bất kỳ nhóm nào từ 14 ngày sau thử thách. Lý do cho điều này vẫn chưa được khám phá ra nhưng vi khuẩn L. garvieae trong điều kiện thí nghiệm đã được chứng minh là gây kích thích nhiễm trùng cấp tính, thường trong vòng 10 ngày sau khi bị nhiễm bệnh. Những con cá nào không ngừng kháng cự trong thời gian này sẽ phục hồi sau khi bị nhiễm trùng và không hẵn không có khả năng chúng có thể loại bỏ vi khuẩn theo thời gian. Tỷ lệ nhiễm trùng thấp trong nghiên cứu của chúng tôi trái ngược lại với các báo cáo từ các nhà nghiên cứu khác nơi mà ở đó tỷ lệ tử vong đáng kể đã được quan sát thấy sau thử thách của cá rô phi với vi khuẩn L. garvieae.

Chúng tôi đã sử dụng hóa mô miễn dịch [ứng dụng duy trì miễn dịch, quá trình xác định chọn lọc các kháng nguyên (protein) trong các tế bào của phần mô bằng cách khai thác nguyên tắc kháng thể liên kết đặc biệt với kháng nguyên trong mô sinh học như một phương pháp bổ sung để chứng minh, sự hiện diện của L. garvieae ở đúng vị trí của nó ở các cơ quan khác nhau trong cơ thể cá. Phương pháp này phát hiện cả vi khuẩn có thể sống sót được tại thời điểm lấy mẫu và cả vi khuẩn không thể sống sót được/ bị khử hoạt tính, bao gồm cả các kháng nguyên trong vắc-xin được sử dụng. Do đó, không có gì đáng ngạc nhiên khi vi khuẩn L. garvieae đã được chứng minh trong nhóm được tiêm vắc-xin nơi mà ở đó không có vi khuẩn tương ứng được phân lập lại và phù hợp với những báo cáo trước đó.

Hình 2: nhuộm hóa mô miễn dịch của L. garvieae trong các mô khác nhau của cá rô phi sông Nile sau khi tiêm trong màng bụng. Kháng nguyên vi khuẩn được quan sát là vết đỏ (mũi tên) ở lách (A), gan tụy (gan) (B) và thận (C). Trong gan (B), vi khuẩn tập trung trong và xung quanh các mạch máu, có khả năng là cổng vào. Hình ảnh D là từ gan của một kiểm soát tiêu cực và cho thấy không có vết tích cực.

Trong nghiên cứu của chúng tôi, việc xác minh nhiễm vi khuẩn L. garvieae ở cá rô phi tiến triển rất nhanh, đạt đỉnh điểm trong vòng ba đến năm ngày và phù hợp với những phát hiện của các nhà khoa học khác. Sự phân bố của vi khuẩn L. garvieae ở các mô khác nhau (dựa trên xu hướng và tần suất của các cơ quan bị nhiễm bệnh theo thời gian) mà chúng tôi quan sát thấy từ sự tái phân lập vi khuẩn và hóa mô miễn dịch ở các nhóm tá dược và nhóm đối chứng cho thấy rằng vị trí của vi khuẩn trước tiên xảy ra ở gan, thận và lá lách trước khi lây lan đến não.

Cá rô phi sông Nin được chủng ngừa bằng vắc-xin L. garvieae gốc dầu trong nghiên cứu của chúng tôi đã tạo ra lượng kháng thể cao hơn đáng kể so với nhóm đối chứng hoặc nhóm chỉ được tiêm tá dược sau 21 ngày tiêm vắc-xin. Xu hướng này tiếp tục cho đến ba ngày sau thử thách khi mà các chuẩn độ kháng thể [bao nhiêu kháng thể cụ thể mà một sinh vật đã tạo ra] giảm mạnh. Các chuẩn độ kháng thể cao trong nhóm được tiêm vắc-xin tại thời điểm thử thách và không có vi khuẩn trong các mô của nhóm này (như đã được chứng minh bằng cách không có vi khuẩn bị phân lập lại) cho thấy các kháng thể đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cá chống lại sự nhiễm trùng. Điều này phù hợp với cơ chế hoạt động của vắc-xin có chứa tá dược gốc dầu và các cơ chế bảo vệ đã biết khác chống lại các mầm bệnh ngoại bào.

Quan điểm

Mục tiêu chính của nghiên cứu này là phát triển một loại vắc-xin tự sinh bảo vệ gốc dầu để bảo vệ cá rô phi trên hồ Kariba. Những phát hiện của chúng tôi cho thấy rằng toàn bộ tế bào vi khuẩn gây nhiễm nhân tạo mà chúng tôi đã phát triển có thể bảo vệ cá rô phi sông Nin chống lại nhiễm trùng vi khuẩn L. garvieae. Nhóm được tiêm vắc-xin trong nghiên cứu của chúng tôi được bảo vệ tốt hơn đáng kể so với nhóm tá dược hoặc nhóm đối chứng. Những phát hiện này hỗ trợ các báo cáo của các nhà nghiên cứu khác rằng vắc-xin có chứa tá dược gốc dầu có thể kích thích bảo vệ cá rô phi chống lại nhiễm khuẩn L. garvieae.

Ngoài ra, những kết quả của chúng tôi đưa ra một cách tiếp cận khác để thử nghiệm vắc-xin không liên quan đến tỷ lệ tử vong, phù hợp với phúc lợi của cá và giảm bớt nỗi đau thể xác của cá. Đề xuất các nghiên cứu bổ sung để xác nhận những phát hiện của chúng tôi.